Beljakovine v urinu: metode za določanje

Patološka proteinurija je eden najpomembnejših in trajnih znakov bolezni ledvic in sečil. Določanje koncentracije beljakovin v urinu je bistven in pomemben element urinskega testiranja. Identifikacija in kvantitativna ocena proteinurije je pomembna ne le pri diagnozi številnih primarnih in sekundarnih ledvičnih bolezni, temveč tudi pri oceni sprememb v intenzivnosti proteinurije v dinamiki. Zaznavanje beljakovin v urinu, tudi v sledovih, mora biti zaskrbljujoče zaradi možne bolezni ledvic ali urinarnega trakta in zahteva ponovno analizo. Zlasti je treba omeniti nesmiselnost testiranja urina in zlasti določanje beljakovin v urinu brez upoštevanja vseh pravil za njegovo zbiranje.

Vse metode za določanje beljakovin v urinu lahko razdelimo na:

  • Kakovost,
  • Semikvantitativno
  • Kvantitativno.

Kvalitativne metode

Vsi visokokakovostni vzorci beljakovin v urinu temeljijo na sposobnosti denaturiranja proteinov pod vplivom različnih fizikalnih in kemičnih dejavnikov. V prisotnosti beljakovin v vzorcu urina obstaja bodisi motnost ali izguba flokulentnega sedimenta.

Pogoji za določanje beljakovin v urinu glede na reakcijo strjevanja krvi:

  1. Urin mora biti kisel. Alkalni urin je nakisan z več (2–3) kapljicami ocetne kisline (5–10%).
  2. Urin mora biti jasen. Zamazanost se izloči s pomočjo papirnega filtra. Če motnost ne izgine, dodajte smukec ali požgan magnezijev oksid (približno 1 čajna žlička na 100 ml urina), pretresite in filtrirajte.
  3. Kvalitativni test je treba opraviti v dveh epruvetah, eden od njih - nadzor.
  4. Iskanje umazanije mora biti na črni podlagi v presvetljeni svetlobi.

Kvalitativne metode za določanje beljakovin v urinu vključujejo:

Kot kažejo številne študije, nobeno od številnih znanih metod za kvalitativno določanje beljakovin v urinu ne omogoča pridobitve zanesljivih in ponovljivih rezultatov. Kljub temu se v večini CDL v Rusiji te metode široko uporabljajo kot presejalni testi - v urinu s pozitivnim kvalitativnim odzivom. Med kvalitativnimi reakcijami se pogosteje uporabljata Gellov test in vzorec s sulfosalicilno kislino, vendar se vzorec s sulfosalicilno kislino večinoma šteje za najbolj primeren za odkrivanje patološke proteinurije. Preskus vrenja se trenutno praktično ne uporablja zaradi njegove zahtevnosti in trajanja.

Semikvantitativne metode

Metoda Brandberg-Roberts-Stolnikov temelji na Geller-jevem testu, tako da pri tej metodi opazimo enake napake kot pri Geller-jevem testu.

Trenutno se diagnostični trakovi vedno bolj uporabljajo za določanje beljakovin v urinu. Za polkvantitativno določanje beljakovin v urinu na traku je najpogosteje uporabljeno barvilo bromofenol modro v citratnem pufru. Vsebnost beljakovin v urinu ocenjujemo po intenzivnosti modro-zelene barve, ki se razvije po stiku reakcijske cone z urinom. Rezultat se oceni vizualno ali z uporabo analizatorjev urina. Kljub veliki priljubljenosti in očitnim prednostim suhih kemijskih metod (enostavnost, hitrost analize), te metode analize urina na splošno in zlasti določanje beljakovin niso brez resnih pomanjkljivosti. Ena od njih, ki vodi do izkrivljanja diagnostičnih informacij, je večja občutljivost indikatorja bromofenol modra na albumin v primerjavi z drugimi beljakovinami. V zvezi s tem so testni trakovi v glavnem prilagojeni za odkrivanje selektivne glomerularne proteinurije, ko je skoraj vse beljakovine v urinu predstavljeno z albuminom. Z napredovanjem sprememb in prehodom selektivne glomerularne proteinurije v neselektivno (pojav globulinov v urinu) so rezultati določanja beljakovin podcenjeni glede na prave vrednosti. To dejstvo onemogoča uporabo te metode za določanje beljakovin v urinu za oceno stanja ledvic (glomerularnega filtra) skozi čas. V tubularni proteinuriji so tudi rezultati določanja beljakovin podcenjeni. Določanje beljakovin z uporabo diagnostičnih trakov ni zanesljiv pokazatelj nizke ravni proteinurije (večina trenutno razpoložljivih diagnostičnih trakov nima sposobnosti za ulov beljakovin v urinu pri koncentraciji nižji od 0,15 g / l). Negativni rezultati določanja beljakovin na črtah ne izključujejo prisotnosti globulinov, hemoglobina, uromucoida, Bens-Jonesovega proteina in drugih paraproteinov v urinu.

Kosmiči sluzi z visoko vsebnostjo glikoproteinov (na primer pri vnetnih procesih v sečilih, piuriji, bakteriuriji) se lahko usedejo na indikatorsko območje traku in povzročijo lažne pozitivne rezultate. Lažno pozitivni rezultati so lahko povezani tudi z visoko koncentracijo sečnine. Slaba osvetlitev in slabo zaznavanje barv lahko povzročita netočne rezultate.

V zvezi s tem je treba uporabo diagnostičnih trakov omejiti na postopke pregleda, rezultate, pridobljene z njihovo pomočjo, pa je treba obravnavati le kot indikativno.

Kvantitativne metode

Pravilna kvantitativna določitev beljakovin v urinu v nekaterih primerih ni lahka naloga. Težave pri njegovi rešitvi so določene z naslednjim številom dejavnikov:

  • nizka vsebnost beljakovin v urinu zdrave osebe, pogosto na pragu občutljivosti najbolj znanih metod;
  • prisotnost številnih spojin v urinu, ki lahko motijo ​​potek kemijskih reakcij;
  • pomembna nihanja vsebnosti in sestave beljakovin v urinu pri različnih boleznih, zaradi katerih je težko izbrati ustrezen kalibracijski material.

V kliničnih laboratorijih se pretežno uporabljajo tako imenovane "rutinske" metode za določanje beljakovin v urinu, vendar ne dajejo vedno zadovoljivih rezultatov.

Z vidika strokovnega analitika, ki dela v laboratoriju, mora metoda, namenjena kvantitativnemu določanju beljakovin v urinu, izpolnjevati naslednje zahteve: t

  • imajo linearno razmerje med absorpcijo kompleksa, ki nastane med kemično reakcijo, in vsebnostjo beljakovin v vzorcu v širokem razponu koncentracij, s čimer se izognemo dodatnim operacijam pri pripravi vzorca za študijo;
  • morajo biti enostavni, ne zahtevajo visoko usposobljenega izvajalca, izvajati se morajo z majhnim številom operacij;
  • imajo visoko občutljivost, analitično zanesljivost pri uporabi majhnih količin preučevanega materiala;
  • biti odporni na različne dejavnike (razlike v sestavi vzorca, prisotnost zdravil itd.);
  • sprejemljive cene;
  • biti lahko prilagodljivi na avtomatske analizatorje;
  • rezultat določanja ne sme biti odvisen od sestave beljakovin v vzorcu urina.

Nobena od trenutno znanih metod za kvantitativno določanje beljakovin v urinu ne more v celoti trditi, da je "zlati standard".

Kvantitativne metode za določanje beljakovin v urinu lahko razdelimo na turbidimetrične in kolorimetrične.

Turbidimetrične metode

Turbidimetrične metode vključujejo:

  • določanje beljakovin s sulfosalicilno kislino (SSC),
  • določanje beljakovin s triklorocetno kislino (THC),
  • določanje beljakovin z benzetonijevim kloridom.

Turbidimetrične metode temeljijo na zmanjšanju topnosti urinskih proteinov zaradi nastajanja suspenzije suspendiranih delcev pod vplivom precipitacijskih sredstev. Vsebnost beljakovin v preskusnem vzorcu se ocenjuje bodisi z intenzivnostjo sipanja svetlobe, ki jo določa število delcev, ki razpršujejo svetlobo (nefelometrična metoda analize), bodisi z zmanjšanjem svetlobnega toka z nastalo suspenzijo (turbidimetrična metoda analize).

Velikost sipanja svetlobe v padavinskih metodah zaznavanja beljakovin v urinu je odvisna od številnih dejavnikov: hitrosti mešanja reagentov, temperature reakcijske zmesi, pH medija, prisotnosti tujih spojin, metod fotometrije. Skrbno upoštevanje reakcijskih pogojev prispeva k tvorbi stabilne suspenzije s konstantno velikostjo delcev in pridobitvijo relativno ponovljivih rezultatov.

Nekatera zdravila vplivajo na rezultate turbidimetričnih metod za določanje beljakovin v urinu, kar vodi do tako imenovanih "lažno pozitivnih" ali "lažno negativnih" rezultatov. Med njimi so nekateri antibiotiki (benzilpenicilin, kloksacilin, itd.), Snovi, ki vsebujejo jod, ki vsebujejo jod, in sulfa.

Turbidimetrične metode so slabo standardizirane, kar pogosto vodi do napačnih rezultatov, toda kljub temu se zaradi nizkih stroškov in razpoložljivosti reagentov pogosto uporabljajo v laboratorijih. Najbolj razširjena metoda v Rusiji je določanje beljakovin s sulfosalicilno kislino.

Kolorimetrične metode

Najbolj občutljive in natančne so kolorimetrične metode za določanje celotnih beljakovin v urinu, ki temeljijo na specifičnih reakcijah beljakovinskih beljakovin.

Te vključujejo:

  1. biuretna reakcija,
  2. Lowry metoda
  3. metode, ki temeljijo na sposobnosti različnih barvil za tvorbo kompleksov z beljakovinami:
    • Ponceau S (Ponceau S),
    • Coomassie Brilliant Blue Coomassie Briljantno modra
    • Pirogalol rdeča.

Z vidika izvajalca je v vsakodnevnem delu laboratorija z velikim pretokom raziskav biuretna metoda zaradi velikega števila operacij neprimerna. Hkrati je za to metodo značilna visoka analitična zanesljivost, omogoča določanje beljakovin v širokem razponu koncentracij in odkrivanje albuminov, globulinov in paraproteinov s primerljivo občutljivostjo, zaradi česar se biuretna metoda šteje za referenco in je priporočljiva za primerjavo drugih analitičnih metod za odkrivanje beljakovin v urinu. Biuretna metoda določanja beljakovin v urinu je prednostno izvedena v laboratorijih, ki služijo nefrološkim oddelkom in se uporabljajo v primerih, ko so rezultati določitve z drugimi metodami vprašljivi, kot tudi za določitev količine dnevne izgube beljakovin pri nefroloških bolnikih.

Lowryjeva metoda, ki ima večjo občutljivost kot biuretna metoda, združuje biuretno reakcijo in Folinovo reakcijo na aminokisline tirozin in triptofan v proteinski molekuli. Kljub visoki občutljivosti ta metoda ne zagotavlja vedno zanesljivih rezultatov pri določanju vsebnosti beljakovin v urinu. Razlog za to je nespecifična interakcija Folinovega reagenta z neproteinskimi komponentami urina (najpogosteje aminokisline, sečna kislina, ogljikovi hidrati). Ločitev teh in drugih komponent urina z dializo ali obarjanjem beljakovin omogoča uspešno uporabo te metode za kvantitativno določanje beljakovin v urinu. Nekatera zdravila - salicilati, klorpromazin, tetraciklini lahko vplivajo na to metodo in izkrivljajo rezultate študije.

Zadostna občutljivost, dobra ponovljivost in lahkost določanja beljakovin z veznimi barvili so obetavne, vendar visoki stroški reagentov preprečujejo njihovo širšo uporabo v laboratorijih. Trenutno je metoda pirogalol rdeča v Rusiji vse pogostejša.

Pri proučevanju ravni proteinurije je treba upoštevati, da imajo različne metode za določanje proteinurije različno občutljivost in specifičnost za številne urinske beljakovine.

Na podlagi empiričnih podatkov je priporočljivo določiti beljakovine z dvema različnima metodama in izračunati pravo vrednost z uporabo ene od naslednjih formul:

proteinurija = 0,4799 B + 0,5230 L;
proteinurija = 1,5484 B - 0,4825 S;
proteinurija = 0,2167 S + 0,7579 L;
proteinurija = 1,0748 P - 0,0986 B;
proteinurija = 1.0104 P - 0.0289 S;
proteinurija = 0,8959 P + 0,0845 L;

kjer:
B - merilni rezultat s Coomassie G-250;
L je rezultat merjenja z Lowryjevim reagentom;
P - rezultat merjenja s pirogalolnim molibdatom;
S je rezultat merjenja z sulfosalicilno kislino.

Glede na izrazita nihanja ravni proteinurije v različnih dnevnih časih in odvisnost koncentracije beljakovin v urinu od diureze, njene različne vsebnosti v posameznih porcijah urina, je za patologijo ledvic zdaj običajno, da oceni resnost proteinurije zaradi dnevne izgube beljakovin v urinu, tj. dnevna proteinurija. Izražena je vg / dan.

Če dnevnega urina ni mogoče zbrati, je priporočljivo določiti koncentracijo beljakovin in kreatinina v eni porciji urina. Ker je hitrost sproščanja kreatinina čez dan dokaj stalna in ni odvisna od sprememb v stopnji uriniranja, je razmerje med koncentracijo beljakovin in koncentracijo kreatinina konstantno. To razmerje se dobro ujema z dnevnim izločanjem beljakovin in se zato lahko uporablja za oceno resnosti proteinurije. Normalno razmerje beljakovin / kreatinina mora biti manjše od 0,2. Protein in kreatinin merimo vg / l. Pomembna prednost metode ocenjevanja resnosti proteinurije z razmerjem protein-kreatinin je popolna odstranitev napak, povezanih z nezmožnostjo ali nepopolnim zbiranjem dnevnega urina.

Literatura:

  • O. V. Novoselova, M. B. Pyatigorskaya, Yu. E. Mihajlov, "Klinični vidiki odkrivanja in vrednotenja proteinurije", Priročnik vodje CPL, št. 1, januar 2007
  • A. V. Kozlov, "Proteinurija: metode za njeno odkrivanje", predavanje, St. Petersburg, SPbMAPO, 2000
  • VL Emanuel, “Laboratorijska diagnostika bolezni ledvic. Urinarni sindrom “, - Priročnik vodje KDL, št. 12, december 2006
  • V.I. Pupkova, L.M. Prasolov - Določanje beljakovin v urinu in cerebrospinalni tekočini. Koltsovo, 2007
  • Priročnik kliničnih laboratorijskih raziskovalnih metod. Ed. E. A. Kost. Moskva, "Medicina", 1975

Sorodni članki

Kvantitativne metode za določanje celotnih urinskih beljakovin

Vsak vzorec urina je primeren za kvantifikacijo beljakovin. Večina raziskovalcev raje določi količino beljakovin v urinu, ki se zbere na dan, da bi ugotovila dnevno izgubo beljakovin.

Oddelek: Analiza urina

Semikvantitativne metode za določanje celotnih beljakovin v urinu

Trenutno se diagnostični trakovi vedno bolj uporabljajo za določanje beljakovin v urinu. Za polkvantitativno določanje beljakovin v urinu na traku je najpogosteje uporabljeno barvilo bromofenol modro v citratnem pufru. Vsebnost beljakovin v urinu ocenjujemo po intenzivnosti modro-zelene barve, ki se razvije po stiku reakcijske cone z urinom.

Oddelek: Analiza urina

Kvalitativne metode za določanje skupnih beljakovin v urinu

Vsi visokokakovostni vzorci beljakovin v urinu temeljijo na sposobnosti denaturiranja proteinov pod vplivom različnih fizikalnih in kemičnih dejavnikov. V prisotnosti beljakovin v vzorcu urina obstaja bodisi motnost ali izguba flokulentnega sedimenta.

Oddelek: Analiza urina

Določanje beljakovin v vzorcu z 20% sulfosalicilne kisline

Vzorec z 20% sulfosalicilno kislino se nanaša na kvalitativne reakcije za določanje beljakovin v urinu. Ker temelji na koagulacijski reakciji, mora preskušani urin izpolnjevati določene zahteve: biti prosojen in imeti kislo reakcijo.

Oddelek: Analiza urina

Geller test

Geller test je kvalitativna reakcija za določanje beljakovin v urinu. Ker temelji na koagulacijski reakciji, mora preskušani urin izpolnjevati določene zahteve: biti prosojen in imeti kislo reakcijo.

Oddelek: Analiza urina

Metode za določanje beljakovin v urinu

Majhno količino beljakovin v dnevnem urinu najdemo tudi pri popolnoma zdravih osebah, vendar pa se takšne majhne koncentracije ne zaznavajo v posameznih obrokih z uporabo trenutno uporabljenih metod. Približno 70% urinskih beljakovin zdravega človeka predstavlja uromucoid, beljakovino, ki je produkt ledvičnega tkiva; tako je delež glomerularnih beljakovin v urinu zdravih ljudi zanemarljiv in proteinurija je običajno 50-150 mg / dan, pri čemer je večina beljakovin v urinu enaka sirotki.

Sprejemljivo je razlikovati med naslednjimi oblikami proteinurije, odvisno od kraja izvora: prerenalna, povezana s povečano razgradnjo beljakovin v tkivih, hudo hemolizo; ledvic, zaradi patologije ledvic, ki se lahko razdeli na glomerularno in tubularno; postrenalno, povezano s patologijo sečil in najpogosteje povzročeno z vnetnim izločanjem.


Odvisno od trajanja obstoja, oddajajo trajno proteinurijo, ki obstaja že več tednov in celo let, in prehodna, ki se občasno pojavlja, včasih tudi v odsotnosti bolezni ledvic, na primer s povišano telesno temperaturo in hudo zastrupitvijo. Priporočljivo je razlikovati med variabilnostjo proteinurije: z dnevno izgubo beljakovin do 1 g - zmerno, od 1 do 3 g - srednje in več kot 3 g - izrazito.

Odkrivanje beljakovin z relativno veliko molekulsko maso v urinu pomeni odsotnost selektivnosti ledvičnega filtra in njegovo izrazito škodo. V teh primerih govorimo o nizki selektivnosti proteinurije. Zato je zdaj definicija frakcij beljakovin v urinu razširjena. Najbolj natančne metode so elektroforeza v škrobnih in poliakrilamidnih gelih.
Glede na rezultate teh metod lahko presodimo selektivnost proteinurije.

Večina kvalitativnih in kvantitativnih metod za določanje beljakovin v urinu temelji na koagulaciji v volumnu urina ali na vmesniku med mediji (urin in kislina); če obstaja način za merjenje intenzivnosti koagulacije, potem postane vzorec kvantitativno.

Analiza poenotene sulfosalicilne kisline:

Zahtevani reagent:

20% raztopina sulfosalicilne kisline.

Potek študije:

V 2 epruveti nalijemo 3 ml filtriranega urina. V epruveto dodamo 6-8 kapljic reagenta. Na temnem ozadju primerjajte kontrolno cev z izkušeno. Zamazanost v epruveti kaže prisotnost beljakovin, vzorec pa velja za pozitiven.

Če je reakcija urina alkalna, potem se pred pregledom nakisamo z 2-3 kapljicami 10% -ne vodne raztopine ocetne kisline.

Enotna metoda Brandberg-Roberts-Stolnikov:

Metoda temelji na Gellerjevem vzorcu, ki je sestavljen iz dejstva, da se na meji dušikove kisline in urina v prisotnosti beljakovine pojavi njegova koagulacija in pojavi se bel obroč.

Zahtevani reagent:

30% raztopina dušikove kisline (relativne gostote 1,2) ali reagenta Larionic.
Priprava reagenta Larion: 20-30 g natrijevega klorida raztopimo s segrevanjem v 100 ml destilirane vode, pustimo ohladiti, filtriramo. V 99 ml filtrata vlijemo 1 ml koncentrirane dušikove kisline.

Potek študije:

V epruveto nalijemo 1-2 ml dušikove kisline (ali reagenta lionske kisline) in previdno, čez steno cevke, enakomerno filtriramo urin. Videz tankega belega obroča na vmesniku dveh tekočin med 2. in 3. minuto kaže na prisotnost beljakovin v koncentraciji približno 0,033 g / l. Če se prstan pojavi prej kot 2 minuti po nanosu, je treba urin razredčiti z vodo in ponovno nanesti že razredčen urin. Stopnja razredčitve urina je izbrana glede na vrsto obroča, t.j. njegova širina, kompaktnost in čas videza. Z navojnim obročem, ki se je pojavil prej 2 minuti, se urin razredči 2-krat, širok - 4-krat, s kompaktnim - 8-krat, itd. Koncentracija beljakovin se izračuna z množenjem 0,033 s stopnjo redčenja in se izrazi v gramih na 1 l (g / l).

Včasih dobimo bel obroč, ko so prisotne velike količine uratov. V nasprotju z beljakovinskim obročem je urat nekoliko višji od meje med dvema tekočinama in se raztopi, ko se rahlo segreje.

Kvantitativna določitev beljakovin v urinu z motnostjo, ki nastane z dodajanjem sulfosalicilne kisline:

Načelo metode:

Intenzivnost motnosti med koagulacijo beljakovin s sulfosalicilno kislino je sorazmerna z njeno koncentracijo.

Zahtevani reagenti:

1. 3% raztopina sulfosalicilne kisline.

2. 0,9% raztopina natrijevega klorida.

3. Standardna raztopina albumina - 1% raztopina (1 ml raztopine, ki vsebuje 10 mg albumina): 1 g liofiliziranega albumina (iz humanega ali govejega seruma) se raztopi v majhni količini 0,9% raztopine natrijevega klorida v bučki s prostornino 100 in nato z isto raztopino nastavimo na oznako. Reagent se stabilizira z dodatkom 1 ml 5% raztopine natrijevega azida (NaN3). Ko je reagent shranjen v hladilniku, velja 2 meseca.

Posebna oprema - fotoelektrični kolorimeter.

Potek študije:

V epruveto nalijemo 1,25 ml filtriranega urina, dopolnimo do 5 ml s 3% raztopino sulfosalicilne kisline in premešamo. Po 5 minutah se merijo na fotoelektričnem kolorimetru pri valovni dolžini 590–650 nm (oranžni ali rdeči svetlobni filter) proti kontroli v celici z dolžino optične poti 5 mm. Kontrola je epruveta, v katero je bilo dodanih 1,25 ml filtriranega urina do 5 ml 0,9% raztopine natrijevega klorida. Izračun se izvede v skladu z umeritvenim časovnim načrtom, za izdelavo katerih razredčine pripravimo iz standardne raztopine, kot je navedeno v tabeli.

Iz vsake dobljene raztopine se vzame 1,25 ml in obravnava kot poskusni vzorec.

Pravokotna odvisnost pri gradnji umeritvenega grafa je shranjena do 1 g / l. Pri višjih koncentracijah je treba vzorec razredčiti in upoštevati izračun razredčitve.

Lažno pozitivne rezultate lahko dosežemo, če v urinu vsebuje organski jod kontrastna sredstva. Zato se test ne sme uporabljati pri osebah, ki jemljejo jodove pripravke; zaradi lažno pozitivnega rezultata lahko pride tudi zaradi pripravkov sulfanilamida, velikih odmerkov penicilina in pri visokih koncentracijah v urinu sečne kisline.

Biuretska metoda:

Načelo metode:

Peptidne vezi proteina z bakrovimi solmi v alkalni C tvorijo kompleks vijolične barve. Proteini se predhodno oborijo s triklorocetno kislino.

Zahtevani reagenti:

1. 10% raztopina trikloroocetne kisline.
2. 20% raztopina bakra (CuSO4 H 5H2O).
3. 3% raztopina NaOH.

Potek študije:

5 ml urina, vzetih iz dnevne količine, dodamo 3 ml raztopine triklorocetne kisline, centrifugiramo do konstantnega volumna usedline. Supernatant se odsesa s pipeto, oborino nato raztopimo v 5 ml raztopine NaOH. K raztopini dodamo 0,25 ml CuS04, zmes mešamo in centrifugiramo. Supernatant se fotometrira pri valovni dolžini 540 nm v kiveti z dolžino optične poti 10 mm proti destilirani vodi. Koncentracija beljakovine se izračuna iz umeritvene krivulje, medtem ko se grafično prikaže koncentracija proteina (g / l) na osi y in optična gostota v ekstinkcijskih enotah na osi abscise. Na podlagi pridobljene koncentracije izračunamo dnevno izgubo beljakovin v urinu.

Uporaba indikatorskega papirja (trakov):

Protein je mogoče zaznati z indikatorskim papirjem (trakovi), ki ga proizvajajo “Albuphan”, “Ames” (Anglija), “Albustix”, “Boehringer” (Nemčija), “Comburtest”, itd.

Načelo temelji na pojavu tako imenovane proteinske napake nekaterih kislinsko-baznih indikatorjev. Indikacijski del papirja je nasičen s tetrabromofenol modro in citratnim pufrom. Ko je papir navlažen, se pufer raztopi in zagotovi ustrezen pH indikatorske reakcije.

Pri 3,0-3,5 amino skupini beljakovine reagirajo z indikatorjem in spremenijo svojo prvotno rumeno barvo v zelenkasto modro, po tem pa lahko v primerjavi z barvno lestvico grobo ocenimo koncentracijo beljakovin v urinu. Glavni predpogoj za pravilno delovanje indikatorskih trakov je, da se zagotovi pH v razponu od 3,0 do 3,5 za reakcijo.

Če je papir v stiku z urinom, ki se preučuje, dlje kot izpostavljenost, ki je navedena v navodilih, se citratni pufer raztopi v njem, nato pa indikator reagira na pravi pH urina, t.j. daje lažno pozitivno reakcijo. Ker je zmogljivost pufra omejena, čeprav se smernice upoštevajo pri vzorcih preveč alkalne urina (pH> 6,5), se dobijo lažno pozitivni rezultati in v vzorcih preveč kislega urina (pH 6.5) z nizko relativno gostoto. z nizko koncentracijo bens jones proteina.

Zahtevani reagenti:

2 M acetatni pufer pH 4.9.

Potek študije:

Filtriran urin v količini 4 ml pomešamo z 1 ml pufra in segrevamo 15 minut v vodni kopeli pri temperaturi 56 ° C. V prisotnosti beljakovin Bens-Jones se v 2 minutah pojavi izrazita oborina, in če je koncentracija beljakovine Bens-Jones manjša od 3 g / l, je lahko vzorec negativen. V praksi je to zelo redko, saj je koncentracija beljakovine Bens-Jones v urinu precejšnja.

S popolno gotovostjo lahko beljakovino Bens-Jones odkrijemo z imunoelektroforetično študijo z uporabo specifičnih serumov proti težkim in lahkim verigam imunoglobulinov.

Določanje albumoze (proteoze):

Albumozi so produkti cepitve beljakovin, katerih načelo temelji na dejstvu, da se pri kuhanju ne prekrivajo, temveč dajo pozitivno biuretno reakcijo in se solijo z nekaterimi solmi, zlasti amonijevim sulfatom in cinkovim acetatom v kislem mediju.

Normalni urin ne vsebuje albumoze. Sledi so lahko v normalnem urinu v primeru nečistoče semena. Pri patologiji se lahko pojavijo albumoze v urinu med febrilnimi stanji, transfuzijo krvi in ​​plazme, resorpcija eksudatov in transudatov ter razpad tumorjev.

Zahtevani reagenti:

1. Nasičena raztopina natrijevega klorida.
2. Koncentrirana raztopina kaustične sode.
3. Šibka raztopina bakrovega sulfata (skoraj brezbarvna).

Potek študije:

V urin dodamo nasičeno raztopino natrijevega klorida (1/3 volumna), nakisano z ocetno kislino, kuhamo in filtriramo vročo tekočino. Albumozi prehajajo v filtrat, v katerem je njihova prisotnost določena z biuretno reakcijo. K filtratu dodajte 1/2 volumna koncentrirane raztopine kavstične sode in nekaj kapljic šibke raztopine bakrovega sulfata. Pri pozitivnem vzorcu dobimo rdečo-vijolično barvo.

S pozitivnim testom s sulfosalicilno kislino se urin segreje. Če motnost izgine in se ponovno pojavi, ko se ohladi, to pomeni, da urin vsebuje albumine ali beljakovinsko telo Bens-Jones.

Beljakovine v urinu, laboratorijski testi

Metode za določanje beljakovin v urinu

Za kliniko je pomembna kvalitativna in kvantitativna določitev beljakovin v urinu.

Kvalitativni testi za določanje beljakovin v urinu
Predlagali več kot 100 reakcij za kvalitativno določitev beljakovin v urinu. Večina jih temelji na beljakovinskih padavinah s fizikalnimi (ogrevalnimi) ali kemičnimi sredstvi. Prisotnost beljakovin dokazuje pojav motnosti.

Zanimivi so tudi kolorimetrični suhi vzorci.

Spodaj bo opisan samo najpomembnejši za prakso vzorca.

Analiza sulfosalicilne kisline. V nekaj mililitrov urina dodajte 2-4 kapljice 20% raztopine sulfosalicilne kisline. Ko se pojavi pozitivna reakcija, je motnost. Rezultat je označen z izrazi: opalescenca, šibko pozitivna, pozitivna ali močno pozitivna reakcija. Test za sulfosalicilno kislino je eden izmed najbolj občutljivih vzorcev za vzpostavitev beljakovin v urinu. Najde celo najmanjše nenormalno povečanje količine beljakovin v urinu. Zahvaljujoč preprosti tehniki je ta test našel široko uporabo.

Test z aseptolom. Aseptol je nadomestek za sulfosalicilno kislino. Lahko se pripravi iz materialov, ki so na voljo v vsakem laboratoriju (fenol in žveplova kislina). Kot reagent uporabimo 20% raztopino aseptola. Test se izvaja na naslednji način: v epruveto, ki vsebuje 2-3 ml urina, dodamo 0,5-1-1 ml raztopine aseptola na dno. Če se na meji med dvema tekočinama izkaže beli obroč koaguliranega proteina, je vzorec pozitiven.

Gellerjev test. Pod nekaj mililitri urina se nasoli 1-2 ml 30% dušikove kisline (teža specifične teže 1,20). Če se na vmesniku obeh tekočin proizvaja bel obroč, je vzorec pozitiven. Reakcija postane pozitivna, če je beljakovina večja od 3,3 mg%. Včasih dobimo bel obroč, ko so prisotne velike količine uratov. V nasprotju z beljakovinskim obročem se uratni obroč ne pojavi na meji med obema tekočinama, ampak nekoliko višji. Larionova predlaga, da se namesto 30% dušikove kisline uporabi kot reagent 1% raztopina dušikove kisline v nasičeni raztopini natrijevega klorida; To zagotavlja velike prihranke dušikove kisline.

Vzorec z zlezystosinerodisty kalija in ocetne kisline. Ta reakcija omogoča izolacijo serumskih proteinov iz nukleoalbumina.

Enake količine urina se vlijejo v dve cevi. V eno od njih dodamo nekaj kapljic 30% raztopine ocetne kisline. Če v primerjavi s kontrolno epruveto dobimo motnost, vsebuje urin nukleoalbumin. Če se ne pojavi motnost, se vsebina obeh epruvet zmeša in ponovno razdeli na dva dela. V eno od dveh epruvet se doda nekaj kapljic (presežek lahko spremeni pozitivni vzorec v negativni) 10% raztopine rumene soli (kalijev ferocianidni sirup). V prisotnosti sirotkinih beljakovin dobimo motnost.

S koncentriranim urinom, ki vsebuje velike količine sečne kisline in urata, je treba po predhodnem razredčenju (2 - 3 krat) urina z vodo opraviti vzorec s kalijem in sirupom železa in sirupa. V nasprotnem primeru lahko pride do motnosti, ki jo povzroča oborjena sečna kislina.

To je še posebej pomembno pri preučevanju urina pri dojenčkih, ki vsebuje veliko sečne kisline in urata.

Od preostalih kvalitativnih vzorcev beljakovin v urinu, ki temeljijo na padavinah beljakovin, so našli uporabo: test vrenja, Esbach, Perdi, Roberts, Almen, Balloni, Buro, Claudius, Corso, Dome, Goodmann-Suzanne, Jolla, Exton, Kamlet, Kobuladze, Liliendal-Petersen, Polacci, Pons, Spiegler, Tanre, Thiele, Brown, Tsushia, itd.

Pri izdelavi visokokakovostnih vzorcev beljakovin v urinu, ki temeljijo na odlaganju beljakovin, je treba upoštevati naslednja splošna pravila, katerih kršitev vodi do pomembnih napak v študiji.

1. Preskušani urin mora biti kisel. Z alkalno reakcijo se urin rahlo nakisa z ocetno kislino. Priprava vzorca z alkalnim urinom v primerih, ko se kot reagent uporablja kislina, lahko vodi do nevtralizacije kisline in do negativnega rezultata s pozitivno reakcijo. To še posebej velja za preskus s sulfosalicilno kislino, saj se kislina dodaja v zelo majhnih količinah in se lahko zlahka nevtralizira.

2. Preiskovani urin mora biti pregleden.

3. Vzorce za določanje beljakovin v urinu je treba vedno opraviti v dveh epruvetah, od katerih ena služi kot kontrola. Brez kontrolne cevi med reakcijami ni opaziti svetlobe.

4. Količina dodane kisline v vzorcih ne sme biti prevelika. Velika količina kisline lahko privede do tvorbe topnega kislinskega albumina in do transformacije pozitivnega vzorca v negativno.

Kolorimetrični suhi vzorci si zaradi svoje enostavne tehnike zaslužijo veliko pozornosti. Pri uporabi teh vzorcev je učinek, ki ga ima beljakovina na barvo indikatorja v puferski raztopini (ti indikatorji napak beljakovin). V kratkem času se v urin absorbira filtrirni papir, napolnjen s pufrom citronske kisline in bromofenol modro. Vzorec je pozitiven, če postane modro-zelena. Če primerjamo intenzivnost obarvanja s standardi barvnega papirja, je mogoče izpeljati približno in kvantitativne zaključke. Indikatorski papir se prodaja v pakiranjih z ustreznimi barvnimi standardi, kot je univerzalni indikatorski papir.

Metode za kvantitativno določanje beljakovin v urinu
Predložene so bile številne metode za kvantitativno določanje beljakovin v urinu. Natančne kvantitativne metode za določanje beljakovin v biološkem materialu se zaradi kompleksnih in dolgotrajnih tehnik ne uporabljajo široko pri določanju beljakovin v urinu. Volumetrične metode so zelo razširjene, zlasti metoda Esbach. So zelo preproste, vendar žal niso zelo natančne. Metode skupine Brandberg-Stolnikov, ki dajejo natančnejše rezultate kot volumetrične metode, s sorazmerno preprosto tehniko, so primerne tudi za kliniko. V prisotnosti fotometra ali nefelometra so primerne tudi nefelometrične metode.

Esbachova metoda. Predlagal ga je pariški zdravnik Esbach leta 1874. Posebno cevko (Esbachov albuminometer) nalijemo z urinom in reagentom. Cev je zatesnjena z gumijastim zamaškom, temeljito premešana (brez udarcev!) In ostala v pokončnem položaju do naslednjega dne. Sporočite delitev, ki doseže kolono beljakovinske oborine. Najdeno število kaže vsebnost beljakovin. Z Esbachovo metodo je zelo pomembno, da je urin kisel. Alkalni urin lahko nevtralizira kisle sestavine reagenta in prepreči obarjanje beljakovin.

Prednosti metode: v praksi je preprosta in priročna.

Slabosti: metoda je netočna, rezultat se doseže po 24 - 48 urah.

Brandberg-Stolnikovova metoda. Temelji na Gellerjevem testu kakovosti. Gellerjev vzorec se lahko uporabi za kvantitativno določanje, ker daje pozitivni rezultat z vsebnostjo beljakovin nad 3,3 mg%. To je končna koncentracija beljakovin, pod katero vzorec postane negativen.

Sprememba Ehrlicha in Althausena. Sovjetski znanstveniki S. L. Ehrlich in A. Ya. Altgauzen sta spremenila Brandberg-Stolnikovovo metodo, kar kaže na možnosti poenostavitve raziskav in prihranka časa pri njegovi proizvodnji.

Prva poenostavitev je povezana s časom nastanka obroča. Natančno je določen čas njegovega nastopa, ne da bi se nujno držali 2. in 3. minute.

Druga poenostavitev omogoča določitev vrste vzreje. Avtorji so dokazali, da lahko zahtevano razredčitev približno določimo z vrsto dobljenega obroča. Razlikujejo nitaste, široke
in kompaktni prstan.

Od nefelometričnih metod je treba omeniti metodo Kingsberry in Clark. 2,5 ml filtriranega urina se vlije v majhen merilni valj, dopolni s 3% vodno raztopino sulfosalicilne kisline na 10 ml. Dobro premešamo in po 5 minutah fotometriramo v kiveti velikosti 1 cm, z rumenim filtrom in uporabimo vodo kot kompenzacijsko tekočino. S fotometrom Pulfrich ugotovljeno izumrtje, pomnoženo z 2,5, daje količino beljakovin v% o. V primeru, da je indeks ekstinkcije višji od 1,0, se urin predhodno razredči 2-krat, 4-krat ali celo več.

Da bi dobili jasno predstavo o količini beljakovin, ki se izločajo v urinu, je treba določiti ne le njihovo koncentracijo v ločenem delu urina, temveč tudi njihovo skupno dnevno količino. V ta namen zberemo 24 urni urin, izmerimo njegovo prostornino v mililitrih in določimo koncentracijo beljakovin v dnevnem urinu v g%. Količina beljakovin, ki se izločijo v urinu v 24 urah, se določi glede na dnevno količino urina v gramih.

Klinični pomen beljakovin v urinu

Humani urin običajno vsebuje minimalne količine beljakovin, ki jih ni mogoče ugotoviti z običajnimi kvalitativnimi vzorci za testiranje beljakovin v urinu. Izločanje velikih količin beljakovin, pri katerih navadni visokokakovostni vzorci za beljakovine v urinu postanejo pozitivni - nenormalni pojav, imenovan proteinurija. Proteinurija je fiziološka le pri novorojenčku, v prvih 4-10 dneh po rojstvu. Ime albuminurija, ki se običajno uporablja, je napačno, saj se ne le albumin, ampak tudi druge vrste beljakovin (globulini, itd.) Izločajo z urinom.

Proteinurijo, kot diagnostični simptom, je leta 1770 odkril Cotuno.

Najpomembnejša funkcionalna ledvična proteinurija pri otrocih je naslednja:

1. Fiziološka proteinurija novorojenčka. Pojavlja se pri večini novorojenčkov in nima nobenega škodljivega pomena. Razlaga je nezreli renalni filter, poškodba pri rojstvu ali izguba tekočine v prvih dneh življenja. Fiziološka proteinurija izgine na 4-10. Dan po rojstvu (kasneje pri nedonošenčkih). Količina beljakovin je majhna. Je nukleoalbumin.

Neonatalna albuminurija, ki traja dolgo časa, je lahko simptom kongenitalne lues.

2. Albuminurija možganske kapi. Povzročajo jih prekoračitev praga normalne razdražljivosti ledvičnega filtra zaradi pomembnih mehanskih, toplotnih, kemičnih, duševnih in drugih draženja - izguba tekočine pri dojenčkih (dehidracijska proteinurija), hladno kopanje, bogata hrana, bogata z beljakovinami (prebavna proteinurija), palpacija ledvic (palpatorna albuminurija), palpacija ledvic (palpatorna albuminurija), fizično preobremenjen, strah itd.

Albuminurija možganske kapi se lažje pojavi pri otrocih v zgodnjem otroštvu kot pri otrocih starejše starosti in pri odraslih, saj so ledvice dojenčka in majhnega otroka lažje razdražene. Dehidracija albuminurije (motnje hranjenja, hidrolabilnost, toksikoza, driska, bruhanje) je še posebej pogosta pri dojenčkih.

Albuminurija možganske kapi je benigna. Izginjajo takoj po odpravi vzrokov. Občasno se v usedlini pojavijo občasni levkociti, valji in rdeče krvne celice. Protein je najpogosteje nukleoalbumin.

3. Ortostatska proteinurija. Ta pogoj je značilen za otroke predšolske in šolske starosti. Pojavi se na podlagi vazomotornih motenj v prekrvavitvi ledvic. Za ortostatsko albuminurijo (od tod tudi njeno ime) je značilno, da se pojavi le, ko otrok stoji, ko je hrbtenica v lordotičnem položaju. V ležečem položaju izgine. Sproži se nukleoalbumin. V dvomljivih primerih lahko uporabite ortostatsko izkušnjo, ki je sestavljena iz naslednjega: zvečer, eno uro pred ležanjem, otrok izprazni mehur; zjutraj, ko vstaneš iz postelje, spet sprošča urin. Ta urin ne vsebuje beljakovin. Nato otroka na kolena položimo za 15-30 minut s palico za hrbtom, med komolci obeh ukrivljenih rok. Ustvari položaj lordoze, ki vodi do sproščanja beljakovin, brez sprememb v sedimentu.

Z ortostatsko albuminurijo se lahko sprosti 8–10 g beljakovin na dan.

Organska ledvična proteinurija je med vsemi proteinurijami pomembnega kliničnega pomena. Povzročajo jih organske ledvične bolezni (nefritis, nefroza, nefroskleroza). Proteinurija je eden najpomembnejših in najbolj znanih simptomov organske ledvične bolezni.

1. Pri akutnih in kroničnih glomerulonefritih se redno pojavlja proteinurija. Količina beljakovin je zmerna in ne obstaja vzporednica med stopnjo proteinurije in resnostjo bolezni. V nasprotju s tem pa se kronična in hujša žad pogosto pojavlja pri manjših količinah beljakovin kot akutna. Po akutnem nefritisu, včasih za daljši čas (leta), so ugotovljene majhne količine beljakovin v urinu, ki nimajo patološkega pomena ("ostanek albuminurije"). Ne smemo pozabiti, da se lahko pojavi tudi »nefritis brez proteinurije«. Včasih se beljakovine nahajajo v enem delu urina, v drugem pa ne. Razmerje med albuminom in globulini pri akutnem nefritisu je majhno, pri kroničnem nefritisu pa višje.

2. V primeru nefroskleroze je količina beljakovin v urinu neznatna, pogosto se pojavijo oblike bolezni brez beljakovin v urinu.

3. Od vseh ledvičnih bolezni se nefroza pojavlja z najbolj izrazito proteinurijo.

4. V primeru infekcijskih in toksičnih razmer najdemo tako imenovano febrilno in toksično proteinurijo. To so akutna nefroza, pri kateri je količina beljakovin majhna. V to skupino spadajo tudi proteinurija v konvulzivnih stanjih (konvulzije), hipertiroidizem, zlatenica, invaginacije, enterokolitis, opekline, huda anemija itd. Ti albuminuriji so benigni in hitro minejo (prehodna albuminurija).

5. Ko se kri v ledvicah stagnira, se pojavi tako imenovana kongestivna albuminurija, ki je značilna za kardiovaskularne bolnike v fazi dekompenzacije. Najdemo ga tudi v ascitesu in tumorjih trebuha.

Pri febrilni, toksični in kongestivni albuminuriji je povečana prepustnost ledvičnega filtra še posebej izrazita. Po mnenju nekaterih avtorjev se mnogi na teh proteinurijih pojavljajo brez organskih poškodb ledvičnega parenhima.

Extrarenalni albuminurijo običajno povzročajo beljakovinske nečistoče (izločki, razgrajene celice), ki jih izločajo oboleli urinarni trakt in spolni organi. Pogosto so ugotovili, da je albuminrija zaradi cistopielitisa (pyuria), redkeje zaradi vulvovaginitisa, kamenca in tumorjev sečil.

Ko extrarenal albuminurija v sedimentu našli veliko število levkocitov in bakterij. Ledvični elementi se skoraj nikoli ne pojavijo. Količina beljakovin je majhna. Filtriran ali centrifugiran urin ponavadi ne daje pozitivnega vzorca beljakovin.

Pri ljudeh, ki se opomorejo od pielitisa, albuminurija izgine po bakteriuriji in puriji.

Kot značilni pojav je treba poudariti, da so organske ledvične bolezni v zgodnjem otroštvu izjemno redke, zato je tudi redka organska proteinurija. Od njih najdemo predvsem febrilno in strupeno. Za razliko od organske proteinurije je albuminurija kapi zelo pogosta pri majhnih otrocih.

Pri starejših otrocih je organska proteinurija pogosteje funkcionalna. Na splošno je s starostjo funkcionalna proteinurija manj pogosta in bolj organska.

Elektroforetske študije beljakovin v urinu

Številni avtorji uporabljajo elektroforetsko metodo za preučevanje beljakovin v urinu (uroproteini). Iz dobljenega elektroforegrama je jasno, da imajo enako kvalitativno sestavo kot plazemski proteini. To kaže, da beljakovine v urinu izvirajo iz beljakovin v plazmi.

Kvalitativna in kvantitativna določitev beljakovin v urinu.

Normalne vrednosti: normalne beljakovine v urinu so v minimalnih količinah, ki jih običajne kvalitativne reakcije ne zaznajo. Zgornja meja norme beljakovin v urinu je 0,033 g / l. Če je vsebnost beljakovin višja od te vrednosti, postanejo visokokakovostni proteinski vzorci pozitivni.

Klinični pomen opredelitve:

Pojav beljakovin v urinu se imenuje proteinurija. Proteinurija je lahko napačna in ledvična. Extrarenalna proteinurija je lahko v prisotnosti nečistoč beljakovinskega izvora iz spolnih organov (vaginitis, uretritis itd.), Količina beljakovin pa je zanemarljiva - do 0,01 g / l. Ledvična proteinurija je lahko funkcionalna (s hipotermijo, fizičnim naporom, zvišano telesno temperaturo) in organsko - z glomerulonefritisom, pielonefritisom, nefritisom, nefrozo, odpovedjo ledvic. Pri renalni proteinuriji lahko vsebnost beljakovin znaša od 0,033 do 10-15 g / l, včasih tudi več.

Načelo metode: temelji na dejstvu, da beljakovine pod vplivom anorganskih kislin koagulirajo (postanejo vidne). Stopnja motnosti je odvisna od količine beljakovin.

Odkrivanje beljakovin v urinu z 20% sulfosalicilno kislino.

Reagenti: 20% raztopina sulfosalicilne kisline. Oprema: temno ozadje.

1. Zahteve za urin: urin mora biti kisel (ali rahlo kisel) pH, mora biti pregleden, zato je urin centrifugiran. Alkalni urin se nakisa na šibko kisli reakcijski medij z uporabo indikatorskega papirja za kontrolo.

2. V 2 epruveti istega premera nalijemo 2 ml pripravljenega urina. 1 - epruveta - nadzor, 2 - izkušnje. V epruveto dodajte 4 kapljice 20% sulfosalicilne kisline.

3. Rezultat je označen na temnem ozadju.

4. V prisotnosti beljakovin se urin v epruveti moti.

Kakovostna določitev beljakovin v urinu s testnimi lističi.

Za identifikacijo proteinurije so uporabljeni različni monotestni trakovi: Albufan, Albustiks, Biofan E in politični testi: Triscan, Nonafan in drugi.

Odkrivanje beljakovin v urinu po metodi Roberts - Stolnikov.

Načelo metode: temelji na dejstvu, da beljakovine pod vplivom anorganskih kislin koagulirajo (postanejo vidne). Stopnja motnosti je odvisna od količine proteina (t.j. Geller test). Ko koncentracija beljakovin v urinu znaša 0,033 g / l, se po treh minutah po nanosu urina pojavi tanka bela nit.

Reagenti: 50% raztopina dušikove kisline ali Robertsovega reagenta (98 delov nasičene raztopine natrijevega klorida in 2 dela koncentrirane klorovodikove kisline) ali reagenta Larionske (98 delov nasičene raztopine natrijevega klorida in 2 dela koncentrirane dušikove kisline).

Oprema: temno ozadje.

1. Zahteve za urin: urin mora biti kisel (ali rahlo kisel) pH, mora biti pregleden, zato je urin centrifugiran. Alkalni urin se nakisa na šibko kisli reakcijski medij z uporabo indikatorskega papirja za kontrolo.

2. V epruveto nalijte 2 ml 50% raztopine dušikove kisline ali enega od reagentov, nato pa s pipeto previdno nalijete enak volumen pripravljenega urina vzdolž stene epruvete.

3. Vzorec se pusti 3 minute

4. Po 3 minutah sporočite rezultat. Rezultat je označen na temnem ozadju v oddani svetlobi. Če je obroč širok, kompakten, se urin razredči z destilirano vodo in ponovno nanese na reagent.

5. Urin se razredči, dokler po 3 minutah ne nastane tanek nitasti obroč.

6. Izračun vsebnosti beljakovin v urinu se pripravi po formuli: t

C = 0,033 g / l x stopnja redčenja.

194.48.155.245 © studopedia.ru ni avtor objavljenih gradiv. Vendar pa ponuja možnost brezplačne uporabe. Ali obstaja kršitev avtorskih pravic? Pišite nam Povratne informacije.

Onemogoči adBlock!
in osvežite stran (F5)
zelo potrebno

Metodični razvoj praktičnega pouka "Določanje beljakovin v urinu" (1 tečaj)

Center za usposabljanje kapitala
Moskva

Tema: Določanje urinskih beljakovin.

Cilj: Študija kemijskih lastnosti urina.

Študija kvantitativnih in kvalitativnih metod za določanje beljakovin v urinu;

Naučite se osnovnih načel dela s testnimi lističi na samodejnih analizatorjih.

Vrsta zaposlitve: praktična (6 ur)

Študent mora vedeti:

Kvalitativni vzorci za določanje beljakovin.

Robertsova - Stolnikovova metoda.

Določanje beljakovin 3% SSC.

Biuretova metoda določanja beljakovin (THU).

Diagnostična vrednost raziskovalnih kazalnikov.

Študent mora biti sposoben:

Pripravite delovno mesto za testiranje urina.

Pripravite reagente, posode in opremo za študijo.

Določiti kemijske lastnosti urina (beljakovine v urinu s kvalitativnimi in kvantitativnimi metodami).

Delo s slepimi izdelki (oblikovanje obrazcev za analizo).

Pravilno razlagati rezultate študije.

Sredstva za doseganje cilja:

1. Delo z notami, izobraževalno in posebno literaturo.

2. Priprava praktičnih vaj z uporabo metodoloških priporočil učitelja, izvedba in izvedba praktičnega dela.

3. Delo z informacijskimi sredstvi izobraževanja v elektronskih in papirnih medijih.

Oprema za študijske sobe in pisarne:

sedežev glede na število študentov;

delovno mesto učitelja;

specializirano pohištvo in oprema.

Orodja za tehnično usposabljanje:

računalniki za opremljanje delovnega mesta učitelja in študentov;

tehnične naprave za avdiovizualni prikaz informacij;

avdiovizualnih učnih pripomočkov (predstavitev, video posnetek).

Rezultat obvladovanja lekcije je:

Oblikovanje praktičnih strokovnih znanj in začetnih praktičnih izkušenj, vključno s strokovnimi (PC) in splošnimi (QA) kompetencami:

PC 1.1. Pripravite delovno mesto za laboratorijske klinične preskuse.

PC 1.2. Izvesti laboratorijske klinične študije bioloških materialov.

PC 1.3. Zabeležite rezultate raziskave.

PC 1.4. Uporabljeni material odstranite, razkužite in sterilizirajte uporabljeno laboratorijsko steklovino, orodje in zaščitno opremo.

OK 1. Razumeti naravo in družbeni pomen njihovega prihodnjega poklica, pokazati stalno zanimanje zanjo.

OK 2. Organizirajte svoje aktivnosti, izberite standardne metode in načine opravljanja strokovnih nalog, ocenite njihovo učinkovitost in kakovost.

OK 6. Delajte v ekipi in ekipi, učinkovito komunicirajte s sodelavci, vodstvom, bolniki.

OK 9. Voditi se v pogojih spremembe tehnologije v poklicni dejavnosti.

OK 13. Organizirati delovno mesto v skladu z zahtevami varovanja dela, industrijske higiene, infektivne in požarne varnosti.

I modul. Teoretični del z elementi samostojnega dela

Naloga številka 1. Študija in opis študijskega gradiva v delovnih zvezkih.

Zdrava oseba običajno vsebuje manj kot 0,002 g / l in redko do 0,012 g / l beljakovin, običajno pa se ta vsebnost beljakovin v urinu imenuje »v obliki sledi« in se ne odkrije s konvencionalnimi kemičnimi metodami pri zdravih človeških urinah.

Vsebnost beljakovin v delih urina, zbranih ob različnih dnevnih časih, se lahko zelo razlikuje.

Beljakovine v urinu imenujemo proteinurija.

Odvisno od dnevne izgube beljakovin se razlikujejo naslednje stopnje proteinurije: zmerna - do 1 g; medij - od 1 do 3 g; izrazit - več kot 3 g.

Obstajata dve glavni vrsti proteinurije:

Proteinurija, ki jo povzročajo bolezni sečil;

proteinurija, z lezijami (boleznimi) ledvic.

Proteinurija, povezana z vnetnimi procesi sečil, ki jo spremlja pojav v urinu večjega števila levkocitov ali eritrocitov, ki pa ne odpravlja istočasnega vnosa beljakovin v urin iz ledvičnega parenhima t vsebnost beljakovin redko presega 1 g / l.

Ledvična proteinurija je v večini primerov povezana s povečano prepustnostjo glomerulov in je razdeljena v 2 skupini:

Med fiziološko proteinurijo spadajo primeri začasnega pojava beljakovin v urinu, ki niso povezani z boleznimi:

po zaužitju velike količine hrane, bogate z nedenaturiranimi beljakovinami (surovo meso, surova jajca);

z intenzivnim mišičnim delom (dolgi pohodi, športni dogodki);

pri hladni kopeli ali prhanju;

z močnimi čustvenimi izkušnjami;

z epileptičnimi napadi.

Razlikujte ortostatsko ali mladostno, proteinurijo, ki se pojavlja pri otrocih in mladostnikih in mimoidočih. V diferencialno-diagnostičnem odnosu je praktično pomembno, da se ortostatska albuminurija pogosto najde v obdobju okrevanja po akutnem glomerulonefritisu.

Patološka ledvična proteinurija je lahko posledica organskih bolezni ledvic in drugih organov in sistemov: akutni glomerulonefritis; kronični glomerulonefritis; akutni pielonefritis; kronični pielonefritis; nefropatija nosečnic; različne bolezni, povezane s povišano telesno temperaturo; hudo kronično srčno popuščanje; in blage bolezni ledvic; lipoidna nefroza; tuberkuloza ledvic; hemoragične vročice; hemoragični vaskulitis; huda anemija; hipertenzija itd.

Naloga številka 2. Prepišite in narišite diagrami laboratorijskih metod za določanje beljakovin v urinu.

Laboratorijske metode za določanje beljakovin v urinu

Obstajajo kvalitativne in kvantitativne metode za določanje beljakovin v urinu, ki temeljijo na koagulaciji beljakovin v volumnu urina ali na meji medijev (urin in kislina); merjenje stopnje koagulacije naredi vzorec kvantitativnega.

vzorec z 20% sulfosalicilno kislino (standardizirano);

Geller test (trenutno se ne uporablja);

detekcija beljakovin z uporabo indikatorskega papirja (trakov) in testnih trakov.

enotna metoda Brandberg-Roberts-Stolnikov;

s 3% sulfosalicilno kislino.

Kvalitativne metode za določanje beljakovin v urinu

Naloga številka 3. Določanje beljakovin v urinu s standardiziranim vzorcem z 20% sulfosalicilne kisline

Načelo metode: temelji na koagulaciji beljakovin v volumnu urina ali na meji medijev (urin in kislina).

Jedi, oprema in reagenti:

20% sulfosalicilne kisline (2-hidroksi-5-sulfobenzojska kislina C 7 H 5 0 6 S).

3 ml filtriranega urina

2 kosa kemijske epruvete

Tri epruvete filtriranega urina vnesemo v dve epruveti, 6-8 kapljic sulfosalicilne kisline dodamo eni od njih (izkušeni). Na temnem ozadju primerjamo obe cevi.

Razlaga rezultatov:

Opacifikacija v epruveti kaže na prisotnost beljakovin v urinu - vzorec je pozitiven.

Opomba Alkalni urin je pred preskusom nakisana z dodajanjem nekaj kapljic 10% raztopine ocetne kisline.

Naloga številka 4. Določanje beljakovin z Geller testom

Načelo metode: Vzorec obroča temelji na dejstvu, da ko se dušikova kislina doda urinu na vmesniku (kislina - urin) v prisotnosti beljakovin, se koagulira in pojavi se bel obroč.

Jedi, oprema in reagenti:

- reagenti: 30% raztopina dušikove kisline (HNO 3) (d = 1,2) ali Laryonic Reactant: 20-30 g natrijevega klorida (NaCl), raztopljenega v 100 ml destilirane vode pri segrevanju, hlajenju, filtriranju; 1 ml koncentriranega HN03 se doda 99 ml filtrata.

V epruveto vlijemo 1 - 2 ml 30% raztopine HNO 3 ali Larionovega reagenta in nežno nanesemo enako količino filtriranega urina na steno.

Razlaga rezultatov:

Pojav na meji dveh tekočin med 2. in 3. minuto tankega belega obroča kaže na prisotnost beljakovin v urinu.

Narišite shemo za določanje beljakovin

Kvantifikacija beljakovin

Načelo metode: Vzorec Gellerjevega obroča temelji na dejstvu, da ko se dušikova kislina doda v urin na vmesniku (kislina - urin) v prisotnosti beljakovin, se koagulira in pojavi se bel obroč.

Jedi, oprema in reagenti:

Biološka tekočina (urin);

V epruveto vlijemo 1 - 2 ml 30% raztopine HNO 3 ali Larionovega reagenta in nežno nanesemo enako količino filtriranega urina na steno.

Razlaga rezultatov:

Pojav na meji dveh tekočin med 2. in 3. minuto
tanek bel obroč kaže prisotnost beljakovine v koncentraciji približno 0,033 g / l. Če se obroč pojavi prej kot 2 minuti po laminaciji, morate urin razredčiti z destilirano vodo in ponovno testirati z razredčenim urinom. Stopnja razredčitve urina je izbrana glede na vrsto obroča, njegovo širino, kompaktnost in čas videza.

Z navojnim obročem, ki se je pojavil prej 2 minuti, se urin razredči 2-krat, širok - 4-krat, s kompaktnim - 8-krat, itd. Koncentracija beljakovin se izračuna z množenjem razredčitve z 0,033 g / l.

Beli prstan lahko nastane, ko je veliko urates; za razliko od beljakovin se zdi nekoliko nad mejo dveh tekočin in se raztopi, ko se rahlo segreje.

Naloga številka 6. Določanje količine beljakovin v urinu s 3% sulfosalicilno kislino

Načelo metode: Koncentracija beljakovin v urinu je sorazmerna z motnostjo, ki nastane, ko koagulira sulfosalicilno kislino

Jedi, oprema in reagenti:

0,9% raztopina natrijevega klorida;

1% standardna raztopina albumina - 1 g liofiliziranega albumina (iz humanega ali govejega seruma) se raztopi v majhni količini 0,9% raztopine NaCl v bučki s prostornino 100 ml in nato dopolni do oznake z istim topilom. Reagent se stabilizira z dodatkom 1 ml 5% raztopine natrijevega azida (NaN 3). Ko je reagent shranjen v hladilniku, je stabilen 2 meseca.

V epruveto vstavimo 1,25 ml filtriranega urina, dodamo 3,75 ml 3% raztopine sulfosalicilne kisline in premešamo. Po 5 minutah se vzorec fotometrira na PEC pri valovni dolžini 590–650 nm (oranžni ali rdeči svetlobni filter) proti kontrolni enoti v kiveti z dolžino optične poti 5 mm. Kontrola služi kot vzorec, v katerem se doda 3,75 ml 0,9% raztopine natrijevega klorida v 1,25 ml urina. Koncentracijo beljakovin izračunamo po kalibracijski krivulji, za izdelavo katere pripravimo razredčitve standardne raztopine albuminov. (glej tabelo). Iz vsake dobljene razredčene raztopine se vzame 1,25 ml in obravnava kot poskusni vzorec.

Priprava razredčitev za umerjanje krivulje

Standardna raztopina, ml

0,9% raztopina natrijevega klorida, ml

Koncentracija beljakovin, g / l

Pravokotna odvisnost obsega ekstinkcije in koncentracije beljakovin se ohranja do 1 g / l. Pri višjih koncentracijah beljakovin je treba vzorec razredčiti in upoštevati izračun razredčitve.

Če so v urinu snovi, ki vsebujejo jod, lahko dobimo lažne pozitivne rezultate. Zato testa ni mogoče uporabiti pri bolnikih, ki jemljejo jodove pripravke ali ki so bili raziskani z uporabo radioaktivnih spojin, ki vsebujejo jod. Lažno pozitivne J reakcije med študijo lahko povzročijo jemanje sulfanilamidnih zdravil, velikih odmerkov penicilina in pri visokih koncentracijah v urinu sečne kisline.

Narišite shemo za določanje beljakovin

Naloga številka 7. Odkrivanje Bens-Jones v urinu

Načelo metode: temelji na reakciji termoprecipitacije

Jedi, oprema in reagenti:

Reagent: 2M acetatni pufer pH 4.9.

4 ml filtriranega urina zmešamo z 1 ml pufrske raztopine in segrevamo 15 minut v vodni kopeli pri 56 ° C.

Razlaga rezultatov:

V prisotnosti Bens-Jonesovega proteina v urinu se v prvih 2 minutah pojavi izrazita usedlina.

Če je koncentracija beljakovin manjša od 3 g / l, je lahko vzorec negativen, kar je precej redko, saj je koncentracija beljakovine Bens-Jones v urinu zelo pomembna.

Najbolj zanesljiva detekcija beljakovine Bens-Jones je z obarjanjem pri temperaturi 40-60 ° C. Pri preveč kislem (pH manj kot 3,0) ali preveč alkalni (pH več kot 6,5) urinu, z nizko gostoto urina in nizko koncentracijo Bens-Jones beige (manj kot 3 g / l), sedimentacija morda ne bo prisotna.

Narišite shemo za določanje beljakovin

II. Samostojno delo z raziskovalno fazo

Naloga številka 1. Študija in opis uporabe št. 1 "Odkrivanje beljakovin z uporabo diagnostičnih testnih trakov"

- Pridobite vzorce biološke tekočine (urina) od učitelja, številke vzorcev;

- Izvedite test urina z uporabo diagnostičnih testnih trakov;

- Ocenite rezultat (norma, patologija). Recimo, da je vzrok beljakovin v urinu.

- Zapišite rezultat v obrazce za analizo, jih predajte učitelju.

"Odkrivanje beljakovin z uporabo diagnostičnih testnih trakov"

Načelo Protein spremeni barvo indikatorja na traku. Indikatorji so pakirani v komplet 100 trakov, ki so shranjeni v tesno zaprtem svinčniku, v hladnem in suhem prostoru.

Pravila za delo z diagnostičnimi testnimi lističi

Pri delu z diagnostičnimi testnimi lističi morate upoštevati naslednja pravila:

- hranite diagnostične testne trakove v tesno zaprtih posodah s kanistri;

- za shranjevanje primerov v temnem, suhem in hladnem prostoru pri temperaturi, ki ne presega 30ºС, vendar ne v hladilniku;

- Trakov ne izpostavljajte vlagi in neposredni sončni svetlobi, visokim temperaturam in hlapnim kemikalijam;

- dobite le nujno potrebno število trakov in nato takoj zaprite ohišje;

- Ne dotikajte se diagnostičnih območij s prsti.

Pravila testiranja

1. Za študijo uporabite jutranji urin, zbran v plastični posodi za urin za enkratno uporabo (ali čisto suho posodo). Mešajte dostavljeni urin, vendar ga ne centrifugirajte.

Če uporabljate nestandardno prilagojeno embalažo, ostanki detergenta v posodi za zbiranje urina povzročajo napačne rezultate.

2. V primeru svinčnika vzemite testni listič.

3. Takoj zaprite ohišje s tovarniškim pokrovom, trak zaščitite pred vlago.

4. Indikatorske papirne trakove spustite 2-3 sekunde v urin, ki ga pregledujete, in jih takoj odstranite.

5. Če želite odstraniti odvečno vlago iz diagnostičnih območij traku, jo napeljite z dolgim ​​robom vzdolž roba vsebnika (ali drugega vsebnika, v katerem je dostavljen urin) ali pa pritrdite ta rob traku na filtrirni papir.

Presežnega urina iz diagnostičnih con ni mogoče izprati.

6. Po preteku časa, ki je naveden na nalepki posode ali v navodilih za vsak preskus, poteče, primerjajte barvo ustreznega diagnostičnega območja z barvno lestvico na etiketi vsebnika s črtami (standardno). Preskusni postopek je prikazan na slikah 1-7.

7. Reakcija je ocenjena kot pozitivna ali negativna. Ali izražena številčno vg / l. (glej risbo 8).